發(fā)布日期：2017-01-19

Francisco Mojica不是第一個(gè)發(fā)現(xiàn)CRISPR的，但他可能是第一個(gè)為它神魂顛倒的科學(xué)家。他記得1992年的那一天，當(dāng)他第一次看到這個(gè)即將開(kāi)啟生物技術(shù)革命的微生物免疫系統(tǒng)。當(dāng)時(shí)他正在審視嗜鹽微生物Haloferax mediterranei的基因組序列數(shù)據(jù)，并注意到14個(gè)不尋常的DNA序列，每個(gè)30個(gè)堿基長(zhǎng)。這些序列大致相同，正向和和反向，每35堿基左右重復(fù)一次。很快，他發(fā)現(xiàn)了更多這樣的序列。Mojica為此著迷，并以此作為他在西班牙阿利坎特大學(xué)的一個(gè)研究焦點(diǎn)。

這是一個(gè)不一般的決定，Mojica實(shí)驗(yàn)室多年來(lái)缺乏資金。在各種會(huì)議上，Mojica會(huì)“逮住”每個(gè)可以找到的重要人物，詢問(wèn)他們對(duì)這些奇怪的小重復(fù)序列的看法。但他們警告Mojica說(shuō)，“不要太在乎這些重復(fù)。在許多生物體中有很多重復(fù)，很多年前我們就已經(jīng)知道了，但仍不清楚它們中有多少是有用的。”

如今，科學(xué)家們?cè)絹?lái)越了解這種被命名為CRISPR（成簇規(guī)律性間隔的短回文重復(fù)序列） 的元件，并且將其作為了一種研究工具，然而雖然大多數(shù)生物醫(yī)學(xué)的研究人員更關(guān)注的是CRISPR-Cas9如何用于編輯基因，但是Mojica和其他微生物學(xué)家仍然 希望了解有關(guān)這個(gè)系統(tǒng)的一些基本問(wèn)題及工作原理：它是如何演變的？如何影響微生物進(jìn)化的？為什么一些微生物中有這一系統(tǒng)，而其它的則不呢？也許CRISPR還有其它未知的基本生物學(xué) 功能？

“媒體大多將注意力放在了作為一種技術(shù)的CRISPR系統(tǒng)，當(dāng)然這有很好的理由，這也是我們發(fā)現(xiàn)的令人難以置信的作用和機(jī)會(huì)。但是與此同時(shí)，還有很多有趣的基礎(chǔ)生物學(xué)研究。”加州大學(xué)伯克利分校生物學(xué)家Jennifer Doudna說(shuō)，她是首位將CRISPR-Cas作為一種基因編輯工具的科學(xué)家之一。

No.1 CRISPR從哪里來(lái)？

CRISPR-Cas的生物學(xué)優(yōu)點(diǎn)已經(jīng)很清楚了。原核生物，包括細(xì)菌和古細(xì)菌（一類(lèi)不太知名的單細(xì)胞生物，其中許多生活在極端環(huán)境中）都需要面對(duì)遺傳侵略者的不斷攻擊。病毒的數(shù)量可能比原核生物多出十倍，據(jù)說(shuō)每?jī)商炷軞⑺廊澜缫话氲募?xì)菌。原核生物還會(huì)交換被稱為質(zhì)粒的DNA碎片，其中包括寄生生物，它們從宿主中獲取資源，如果宿主試圖驅(qū)逐它們，機(jī)體分子就會(huì)迫使其自毀。這世界上似乎沒(méi)有什么地方是安全的，從土壤到海洋，再到地球上最荒涼最不適合生存的地方，遺傳入侵者們一直都存在。

原核生物在進(jìn)化過(guò)程中已經(jīng)發(fā)展出了許多武器來(lái)應(yīng)對(duì)這些威脅。例如，在特定識(shí)別序列處或附近用于切割DNA的酶。但這些防御 并不靈敏，每種酶被需要編程才能識(shí)別某些序列，而且只有當(dāng)微生物具有正確基因的拷貝時(shí)才受到保護(hù)。CRISPR-Cas動(dòng)態(tài)性更強(qiáng)，這類(lèi)似于人體抗體感染后 發(fā)展出的長(zhǎng)期免疫方式，能進(jìn)化和記住特殊的遺傳入侵者。

荷蘭瓦赫寧根大學(xué)的微生物學(xué)家John van der Oost說(shuō)：“我們首次聽(tīng)說(shuō)這個(gè)假說(shuō)時(shí)，認(rèn)為這對(duì)于簡(jiǎn)單的原核生物來(lái)說(shuō)太復(fù)雜了。”

Mojica等人從位于與病毒基因組有時(shí)匹配的CRISPR回文重復(fù)之間的DNA序列中，推導(dǎo)出CRISPR-Cas的功能。從那時(shí)起，研究人員就發(fā)現(xiàn)在細(xì)菌和古細(xì)菌暴露于特定的病毒或質(zhì)粒后，某些CRISPR相關(guān)（Cas）蛋白會(huì)將這些間隔序列添加到基因組中。由這些間隔序列生成的RNA能指導(dǎo)其它Cas蛋白切斷所有匹配序列的入侵DNA或RNA。

那么細(xì)菌和古細(xì)菌如何出現(xiàn)這種復(fù)雜的免疫系統(tǒng)的呢？

這個(gè)問(wèn)題還沒(méi)有答案，但多數(shù)人認(rèn)可的是，這個(gè)系統(tǒng)來(lái)自轉(zhuǎn)座子，也就是可以從基因組中的一個(gè)位置跳到另一個(gè)位置的“跳躍基因”。美國(guó)國(guó)家衛(wèi)生研究院的進(jìn)化生物學(xué)家Eugene Koonin在馬里蘭州貝塞斯達(dá)和他的同事發(fā)現(xiàn)了一類(lèi)編碼蛋白Cas1的可移動(dòng)遺傳元件，Cas1參與間隔序列插入基因組的過(guò)程。這些“casposons（轉(zhuǎn)座子元件，生物通注）”可能就是CRISPR-Cas免疫的起源。研究人員現(xiàn)在正在努力了解這些DNA如何從一個(gè)地方跳到另一個(gè)地方，之后他們還會(huì)追蹤這種機(jī)制如何演化成復(fù)雜的CRISPR-Cas機(jī)制的。

No.2 CRISPR如何發(fā)揮作用的？

近年來(lái)的一些研究已經(jīng)解釋了關(guān)于Cas蛋白如何添加到間隔序列中的許多分子細(xì)節(jié)，但是病毒DNA在化學(xué)上幾乎與宿主DNA相同。那么在包裝有DNA的細(xì)胞中，蛋白如何指導(dǎo)是哪些DNA添加到了CRISPR-Cas“記憶”中？

這種風(fēng)險(xiǎn)很高：如果一種細(xì)菌不小心添加了一種自己的DNA，它可能會(huì)通過(guò)自身免疫自殺。正如立陶宛維爾紐斯大學(xué)的生物化學(xué)家Virginijus Siksnys所說(shuō)的：“這些酶是一把雙刃劍。”

來(lái)自北卡羅來(lái)納州立大學(xué)的微生物學(xué)家 Rodolphe Barrangou認(rèn)為，這可能是因?yàn)榧?xì)菌和古細(xì)菌的龐大群體能承受一些錯(cuò)誤：一些細(xì)胞自殺可能無(wú)關(guān)緊要，只要其它細(xì)胞可以在病毒攻擊后繼續(xù)茁壯成長(zhǎng)就行。

事實(shí)上，當(dāng)病毒入侵一個(gè)細(xì)菌生態(tài)系統(tǒng)時(shí)，通常1000萬(wàn)個(gè)細(xì)菌中只有大約一個(gè)細(xì)菌能正確獲得一個(gè)間隔序列用以自衛(wèi)?？赡苄?這么低，因此針對(duì)驅(qū)動(dòng)間隔序列的因素進(jìn)行研究很困難。

同樣，要了解為什么只有這個(gè)細(xì)胞能夠成功也很困難。“在實(shí)際發(fā)生時(shí)很難捕獲這個(gè)‘成功的’細(xì)菌，”洛克菲勒大學(xué)微生物學(xué)家Luciano Marraffini解釋道。

尋找確定合適間隔序列的方法，并提高它們的整合速率，將會(huì)有助于解開(kāi)這個(gè)謎題。一些研究表明包含有CRISPR-Cas機(jī)制的細(xì)胞或許將其作為一種記錄裝置，對(duì)它們所遇到的DNA和RNA序列進(jìn)行分類(lèi)。這也許同樣也能讓研究人員追蹤一段時(shí)間內(nèi)接觸環(huán)境化學(xué)物質(zhì)后細(xì)胞的基因表達(dá)。

此外研究人員還希望能了解如何修剪舊的記憶，大多數(shù)帶有CRISPR-Cas系統(tǒng)的微生物都含有幾十個(gè)間隔序列，也有的只有一個(gè)。相反，古細(xì)菌Sulfolobus tokodaii則擁有5個(gè)CRISPR-Cas系統(tǒng)，包括458個(gè)間隔序列，占用了其基因組的1％之多。看起來(lái)好像沒(méi)有必要一直保留舊的間隔Spacer，因?yàn)槿绻《就ㄟ^(guò)突變以逃避CRISPR-Cas，那么間隔序列就會(huì)過(guò)時(shí)。而且保留額外的DNA可能會(huì)成為微生物的負(fù)擔(dān)。“一種細(xì)菌不能無(wú)限制地?cái)U(kuò)張其基因組，”以色列魏茨曼科學(xué)研究所遺傳學(xué)家Rotem Sorek說(shuō)。

No.3 CRISPR還有其它的作用嗎？

一些間隔序列的起源帶來(lái)新的問(wèn)題：目前觀察到的間隔序列中能與DNA數(shù)據(jù)庫(kù)中任何已知序列匹配的不超過(guò)3％。

這也就是說(shuō)我們對(duì)病毒可能還知之甚少，大多數(shù)測(cè)序工作都集中在那些會(huì)感染人，牲畜或作物的病毒上。佐治亞大學(xué)的RNA生物學(xué)家Michael Terns說(shuō)：“我們對(duì)細(xì)菌的敵人，特別是古生菌的敵人知之甚少。”

還有一種可能是，一些間隔序列是病毒的“鬼魂”，也就是已經(jīng)不存在的，或者經(jīng)過(guò)突變“認(rèn)不出了”的序列。第三種可能性則越來(lái)越引發(fā)關(guān)注，研究人員也已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一些例子：CRISPR-Cas系統(tǒng)的功能并不限于防范遺傳入侵者。在一些細(xì)菌中，CRISPR-Cas組分能調(diào)控DNA修復(fù)，基因表達(dá)和生物膜的形成。它們還可以決定細(xì)菌感染他人的能力，比如說(shuō)引起軍團(tuán)病（Legionnaires' disease）的Legionella pneumophila必須具有Cas蛋白Cas2，才能感染其天然宿主變形蟲(chóng)。

“一個(gè)主要的問(wèn)題是：除了防御外敵它還具有多少生物學(xué)功能？”麻省大學(xué)醫(yī)學(xué)院的分子生物學(xué)家Erik Sontheimer指出，“這是未來(lái)幾年的關(guān)注焦點(diǎn)。”

Sontheimer還補(bǔ)充說(shuō)，CRISPR也有可能成為另一個(gè)類(lèi)似RNA干擾的發(fā)現(xiàn)，RNA干擾是一種在植物，動(dòng)物和 其它非原核生物中沉默基因表達(dá)的系統(tǒng)，RNA干擾在早期也被認(rèn)為是防御機(jī)制，只是到后來(lái)研究人員才注意到其在調(diào)節(jié)宿主基因表達(dá)中的重要作用。

這也可以解釋為什么一些間隔區(qū)不匹配已知的病毒或質(zhì)粒，荷蘭代爾夫特理工大學(xué)的微生物學(xué)家Stan Brouns說(shuō)：“這些系統(tǒng)并不完美，它們捕獲病毒DNA同時(shí)也捕獲自己的DNA。只要它們不死，一旦開(kāi)始捕獲新的DNA片段，就可以獲得新的功能 。”

No.4 為什么只有一些微生物采用這一系統(tǒng)？

無(wú)論CRISPR-Cas具有什么其它功能，顯然只有一些微生物采用這一系統(tǒng)。超過(guò)90％的古細(xì)菌具有基于CRISPR的免疫系統(tǒng)，但只有約三分之一的已測(cè)序細(xì)菌出現(xiàn)了這一系統(tǒng)。所有的非原核生物，甚至單細(xì)胞生物，都沒(méi)有發(fā)現(xiàn)有CRISPR-Cas。

一種被稱為Nanoarchaeum equitans的古細(xì)菌作為寄生生物，寄生于另一個(gè)生活在接近沸點(diǎn)的水中的古細(xì)菌上，其基因組已經(jīng)刪去了與能量產(chǎn)生和一般細(xì)胞管理相關(guān)的許多基因。然而在其微小的只有490,000個(gè)堿基的DNA中，N. equitans還保留了約30個(gè)間隔序列的CRISPR-Cas系統(tǒng)。“一大部分的基因組仍然放在CRISPR上，”英國(guó)圣安德魯斯大學(xué)的分子生物學(xué)家Malcolm White說(shuō)：“CRISPR一定具有什么重要作用，但我們竟不知道其中的原因。”

英國(guó)?？巳卮髮W(xué)微生物學(xué)家Edze Westra認(rèn)為，這種差異表明一定存在有某些傾向于CRISPR-Cas系統(tǒng)的關(guān)鍵生態(tài)因素，使得病毒防御或其它益處比細(xì)胞自殺的風(fēng)險(xiǎn)更為重要。極端環(huán)境似乎有利于CRISPR-Cas系統(tǒng)，但Westra也指出， 在更舒適環(huán)境的細(xì)菌中，這種系統(tǒng)的出現(xiàn)頻率也不相同。比如當(dāng)一種禽類(lèi)的病原體（Mycoplasma gallisepticum）的宿主從雞轉(zhuǎn)換為野生雀類(lèi)時(shí)，這種細(xì)菌就丟棄了其CRISPR-Cas設(shè)備。為什么這個(gè)系統(tǒng)在雞中就很有用，而在雀類(lèi)中就不好用， 目前還不清楚。

數(shù)學(xué)模型和一些早期的實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)表明，當(dāng)只有幾種類(lèi)型的病毒競(jìng)爭(zhēng)時(shí)，CRISPR-Cas可能更有優(yōu)勢(shì)。在添加的DNA序列還沒(méi)有成為基因組負(fù)荷時(shí)，CRISPR-Cas間隔序列可以記錄有限數(shù)量的病毒序列。如果環(huán)境中的病毒多樣性大大超過(guò)可能的間隔序列數(shù)量，那么CRISPR-Cas系統(tǒng)可能沒(méi)有什么用處。

另一種可能性是在極端環(huán)境中的古生菌不能過(guò)度依賴其它防御手段。細(xì)菌阻止入侵者的一種常見(jiàn)方式是讓自身外殼中稱為包膜的蛋白質(zhì)發(fā)生突變。然而，衣殼蛋白的結(jié)構(gòu)對(duì)于在惡劣條件下生物的生存至關(guān)重要，因此一些古生菌可能難于修改這些衣殼蛋白。

No.5 有多少種CRISPR-Cas？

多數(shù)人傾向于CRISPR-Cas9系統(tǒng)，因?yàn)樗捎糜诨蚪M編輯中，并且簡(jiǎn)單且具有多樣性，但是微生物不喜歡。相反，他們傾向于混合和匹配不同的系統(tǒng)，迅速?gòu)钠渌?xì)菌中學(xué)習(xí)新的細(xì)胞并丟棄舊的細(xì)胞。

研究人員已正式確認(rèn)了6種不同類(lèi)型的CRISPR系統(tǒng)，其中又有19種亞型。“我們其實(shí)只知道它們中的一小部分如何發(fā)揮作用的。”Marraffini說(shuō)。

揭開(kāi)這些機(jī)制可能是找到CRISPR-Cas系統(tǒng)新的生物技術(shù)應(yīng)用的關(guān)鍵。例如，最受歡迎的CRISPR-Cas9是II型系統(tǒng)，它采用的是從間隔序列轉(zhuǎn)錄的RNA分子指導(dǎo)酶切割入侵的病毒或質(zhì)粒DNA。但是在去年6月發(fā)現(xiàn)的VI型系統(tǒng)中的酶切割的是RNA，而不是DNA。另外IV型系統(tǒng)包含一些與CRISPR-Cas相關(guān)的基因，但缺乏重復(fù)和插入間隔序列的機(jī)制。

III型系統(tǒng)是自然界中最常見(jiàn)的CRISPR-Cas系統(tǒng)之一，但卻是研究人員了解最少的一類(lèi)系統(tǒng)。迄今為止的證據(jù)表明，它們響應(yīng)的不是入侵的DNA或RNA本身，而是響應(yīng)將DNA轉(zhuǎn)錄成RNA的過(guò)程。如果證明是這種情況，這將是一種新的調(diào)控形式，可以擴(kuò)展基因組編輯的CRISPR-Cas工具箱。

此外，在研究人員將其搜索范圍從培養(yǎng)的微生物擴(kuò)展到來(lái)自環(huán)境DNA樣品的遺傳序列時(shí)，也有可能會(huì)突然出現(xiàn)其它系統(tǒng)。

對(duì)于Mojica來(lái)說(shuō)，探索這種多樣性，解答關(guān)于CRISPR系統(tǒng)的基本問(wèn)題，比研究它們引發(fā)的技術(shù)革命更有趣。這讓他的許多同事感到困惑，他說(shuō)。Mojica沉浸在CRISPR-Cas生物學(xué)中已經(jīng)25年了，雖然有很多資金涌向編輯基因組研究的科研人員，但是投入到他所做的工作的資金卻很少。

Mojica說(shuō)：“我知道這是一個(gè)偉大的工具。夢(mèng)幻般的可用于治療疾病，但這不是我的事。我想知道系統(tǒng)如何開(kāi)始，又是如何結(jié)束的”。

來(lái)源：生物通